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摘 要：建立气相色谱-三重四极杆质谱测定茶叶中草甘膦和氨甲基膦酸的分析方法。茶样经超纯水、二氯甲烷提取后，与三氟乙酸酐-七氟丁醇进行衍生反应，衍生后产物经乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、石墨化碳（GCB）、C18混合净化剂净化，TG-1701MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）分离，气相色谱-串联质谱进行测定。试验详细考察了 PSA、GCB、C18用量对草甘膦和氨甲基膦酸添加回收率的影响，结果表明，2 mL衍生液中加入50 mg PSA、25 mg GCB和25 mg C18时净化效果最好。在 5 μg/L～500 μg/L 范围内，草甘膦和氨甲基膦酸均有良好的线性关系（r2＞0.999），定量限（LQD）（S/N=10）分别为0.03 mg/kg和0.015 mg/kg，样品加标浓度为0.50、1.00 mg/kg和2.50 mg/kg时，草甘膦的平均回收率为86.1%～101.2%，相对标准偏差（RSD）（n=6）为3.2%～6.7%；氨甲基膦酸的平均回收率为83.6%～103.4%，相对标准偏差（RSD）（n=6）为3.6%～7.3%。该方法样品前处理简单，分析时间短，回收率和精密度等均符合草甘膦和氨甲基膦酸检测技术的要求，适用于茶叶中草甘膦和氨甲基膦酸残留的检测。

关键词：QuEChERS；气相色谱-三重四级杆质谱；草甘膦；氨甲基膦酸；茶叶

草甘膦（glyphosate，Gly），属于广谱、非选择性、灭生性除草剂，由于其具有低廉的价格和优良的除草性能，广泛的应用于橡胶、果园、茶园等少、免耕田除草以及高秆作物田行间定向保护性喷雾除草[1]。草甘膦在环境和生物体中富集并通过食品进入人体，会对人体健康造成危害。近年来，茶叶中草甘膦及其主要代谢产物氨甲基膦酸残留量超标的问题时有发生，这已经影响到消费者的食用安全及茶叶的出口贸易。因此建立一种简便、快捷、有效的草甘膦残留的检测方法具有重要的意义。

草甘膦和氨甲基膦酸都极易溶于水，难溶于有机试剂，挥发性低，难以气化，缺少生色基团，难以直接利用常规方法进行检测[2]。目前，草甘膦的测定常涉及一些特殊的技术手段，如柱前或柱后衍生化处理[2-5]、采用离子交换色谱[6]等进行分析。我国现有的国标方法[7]和行业标准[8]中，前处理采用固相萃取小柱净化，洗脱液中水含量高，浓缩时间长，费时费力。QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe） 技术是一种快速、简单、廉价、高效的样品前处理方法，主要通过非极性相互作用、极性相互作用、离子相互作用等选择性保留基质干扰成分，进而达到净化的效果。QuECh－ERS可以根据不同样品基质以及不同目标物的理化特性差异，并且通过调整提取溶剂、吸附剂等来改进QuEChERS前处理技术，让其应用于更加广泛的领域，但QuEChERS在茶叶中草甘膦和氨甲基膦酸的检测应用报道较少，曹慧等[9]建立了QuEChERS前处理和液质质相结合快速测定了茶叶中草甘膦和氨甲基膦酸含量的方法。国标中的气相色谱-质谱法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 能够对目标化合物进行确证，但是单离子监测（Single ion monitoring，SIM）模式采集的质谱信息较少，选择性差，易受基质干扰，在定性方面存在不足，容易造成假阳性结果，而气相色谱-串联质谱法（gas chromatography-triple quadrupole mass spectrometry，GC-MS/MS） 采用选择反应监测（Selective reaction monitoring，SRM）数据采集模式，可以有效排除基质干扰，使定性定量结果更加可靠[10]。因此本研究拟采用柱前三氟乙酸酐-七氟丁醇衍生和改进的QuEChERS前处理方法，通过GC-MS/MS分析样品，确定柱前衍生-QuEChERS-气相色谱串联质谱法检测茶叶中草甘膦和氨甲基膦酸残留的方法，为实现茶叶中有草甘膦和氨甲基膦酸残留的快速监测提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

TSQ 8000evo气相色谱-三重四极杆串联质谱仪：赛默飞世尔科技有限公司；XS204分析天平：梅特勒-托利多仪器上海有限公司；Allegra 6412冷冻离心机：美国贝克曼库尔特公司；MDF-U54V-PC立式超低温冰箱：日本三洋电器集团；WNE 29水浴振荡器：德国美墨尔特有限公司；Mill-Q去离子水发生器：美国Millipore公司；XH-C涡旋混合器：江苏金怡仪器科技公司；2600T超声波清洗器：上海安谱科学仪器有限公司。

草甘膦（纯度≥99.0%）、氨甲基膦酸（纯度≥99.0%）：德国Dr.Ehrenstorfer公司；三氟乙酸酐、七氟丁醇（分析纯）：上海麦克林生化科技有限公司；二氯甲烷、乙酸乙酯（色谱纯）：德国Merck公司；柠檬醛（分析纯）：阿拉丁试剂有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA）、石墨化碳（graphitized carnon black，GCB）、C18：博纳艾杰尔科技有限公司；绿茶、红茶、乌龙茶样品为实验室送检样品。

1.2 标准溶液和衍生剂的配制

称取草甘膦和氨甲基膦酸标准品各0.05 g，用水溶解并定容至50 mL塑料容量瓶，配制成1 000 mg/L标准溶液，4℃下保存待用。

草甘膦和氨甲基膦酸标准使用溶液：将标准工作溶液用超纯水逐级稀释成浓度为 5、10、25、50、100、250、500 μg/L 标准使用溶液。

衍生剂：三氟乙酸酐-七氟丁醇溶液，将三氟乙酸酐和七氟丁醇溶液2∶1的体积比混合，临配临用，并于-80℃冰箱保存。

1.3 样品前处理

试样制备：选取茶叶样品，用四分法缩减取200 g，粉碎后过1.0 mm孔径筛，混匀备用。

准确称取1 g（精确至0.001 g），置于聚乙烯塑料离心管中，加入25 mL水，涡旋30 s，超声20 min，于3 500 r/min离心10 min。取上清液15 mL至离心管加入15 mL二氯甲烷振荡2 min，于3 500 r/min离心5 min。取上清液待衍生。

取1.6 mL衍生剂于衍生瓶中，加盖后放入-80℃超低温冰箱冷冻0.5 h后取出，用移液枪在衍生剂液面下加入50 μL提取上清液，加盖混匀后90℃衍生1 h。取出冷却至室温，用氮气吹干，并继续氮吹0.5 h，加入2 mL 0.2%柠檬醛乙酸乙酯溶液溶解残渣，待净化。

取2 mL衍生液，加50 mg PSA粉末，25 mg C18粉末，25 mg GCB粉末，涡旋30 s，静置至上层液体无浑浊物；取上层液体过0.22 μm滤膜后上机测定。

标准品按照上述方法衍生后，加入2 mL 0.2%柠檬醛乙酸乙酯溶液溶解残渣过0.22 μm滤膜后上机测定。

1.4 气相色谱-三重四极杆串联质谱条件

1.4.1 色谱条件

色谱柱：TG-1701MS毛细管柱（30.0 m×0.25 mm×0.25 μm）；升温程序：80℃保持 1.5 min，以 30℃/min升温至270℃，保持5 min；进样口温度200℃；流速：1.0 mL/min；进样体积2 μL；进样方式：不分流进样。

1.4.2 质谱条件

电子轰击（electron Ionization，EI）离子源；电离能量70 eV，离子源温度为280℃，传输线温度为270℃，溶剂延迟时间为3.5 min，扫描模式为选择反应监测（selective reaction monitoring，SRM），优化后的保留时间、定性和定量离子对及其碰撞能量信息见表1。

表1 草甘膦和氨甲基膦酸衍生物质谱条件参数
Table1 MS conditions for derivatizations of glyphosate（PMG）and aminomethyl phosphonic acid（AMPA）

图1 草甘膦和氨甲基膦酸衍生物在选择反应监测模式下的总离子流图
Fig.1 Total ion chromatogram of derivatizations of glyphosate（PMG）and aminomethyl phosphonic acid（AMPA）in selected reaction monitoring（SRM）mode

2 结果及讨论

2.1 色谱条件的优化

本文采用GC-MS/MS进行检测，使用单针进样分析目标化合物的混合标准衍生液，对草甘膦衍生物和氨甲基膦酸衍生物进行质谱全扫描分析，参考相关文献资料[7]，确定草甘膦衍生物和氨甲基膦酸衍生物的保留时间。化合物进入一级质谱后，确定母离子，母离子进入二级质谱，对化合物的碰撞能量进行优化。通过Auto SRM软件，对化合物母离子逐步施加一定步长碰撞能量，目标化合物发生断裂或重排，产生不同离子碎片，每个目标化合物选取两对最具特征且响应最高的子离子，最终确定出定性离子对、定量离子对和各个物质的质谱采集参数。SRM模式能够最大限度地消除基质干扰，而且针对化合物扫描时间窗口的设置，提高了灵敏度。草甘膦和氨甲基膦酸的衍生物在SRM模式下的总离子流图如图1所示。

由图1可知，氨甲基膦酸衍生物保留时间为5.93 min；草甘膦衍生物保留时间为6.13 min。

2.3 QuEChERS方法的优化

2.3.1 净化方式的选择

分散固相萃取常用的净化剂有PSA、石墨化炭黑（GCB）和C18等。PSA可吸附糖、有机酸、脂肪酸等极性干扰物；C18可吸附脂肪等非极性干扰物；GCB可吸附色素、甾醇等大分子非极性干扰物[11]。本试验首先分别选用PSA、C18和GCB对加标茶叶样品提取液进行净化，试验结果表明：PSA和GCB对草甘膦和氨甲基磷酸具有较强的吸附性，目标化合物的回收率都低于10%，原因是PSA对分子结构中带有羧基的化合物有一定的保留作用[12]；GCB表面是正六元环结构，对平面分子有极强的亲和力[13]，因此会吸附平面结构的农药，导致回收率低，而C18在水提取液中容易结块，净化效果不佳。因此，QuEChERS法不适用于草甘膦和氨甲基膦酸提取液的直接净化处理。

草甘膦和氨甲基膦酸用三氟乙酸酐和七氟丁醇衍生剂衍生后，氨基基团被衍生为相应的三氟乙酰衍生物，羧基和膦酸基团被衍生形成相应的七氟丁酯。因此，本试验拟先用衍生剂将草甘膦和氨甲基膦酸衍生，然后采用QuEChERS前处理法净化衍生液，降低对离子源的污染，提高灵敏度。本试验以50 μg/L加标水平的茶叶为考察对象，提取液衍生后进行净化处理，并以PSA、GCB、C18的用量为考察因素对净化条件进行优化。

2.3.1.1 净化剂的用量

考察加入的PSA用量对净化效果的影响，试验结果见图2。

图2 2 mL加标提取液中PSA用量对草甘膦衍生物和氨甲基膦酸衍生物回收率的影响
Fig.2 Effect of the amount of PSA added in 2 mL extract on the recoveries of derivatizations of glyphosate（PMG）and aminomethyl phosphonic acid（AMPA）

在2 mL加标基质衍生液中分别加入20、50、100、150、200 mg PSA。PSA具有弱阴离子交换（水溶性基质）、极性（非极性有机基质）螯合作用，可有效去除样品中的有机酸、脂肪酸和糖等干扰物。草甘膦和氨甲基膦酸衍生物的回收率随着PSA用量的增加呈现先增加后下降的状态，并在PSA为50 mg时达到最大值。PSA材料的硅胶表面键合有极性功能团，能吸附极性化合物，而草甘膦和氨甲基膦酸是属于极性较强的化合物，PSA用量过大，吸附完杂质，过多的PSA会对目标化合物产生吸附，因此，最终选用PSA用量为50 mg。

固定PSA用量为50 mg，考察加入的C18用量对净化效果的影响，试验结果见图3。

图3 2 mL加标提取液中C18用量对草甘膦衍生物和氨甲基膦酸衍生物回收率的影响
Fig.3 Effect of the amount of C18 added in 2 mL extract on the recoveries of derivatizations of glyphosate（PMG）and aminomethyl phosphonic acid（AMPA）

在2 mL加标基质衍生液中分别加入10、25、50、75、100 mg C18。C18吸附剂对极性较弱的脂肪酸、烯烃类及甾醇类、色素等大分子基质干扰物有较好的吸附效果。试验发现，随着C18用量的增加，草甘膦和氨甲基膦酸衍生物的回收率变化不大，综合回收率和经济因素，我们最终选用C18为25 mg。

固定 PSA（50 mg）、C18（25 mg）用量，考察 GCB 用量对净化效果的影响，试验结果见图4。

图4 2 mL加标提取液中GCB用量对草甘膦和氨甲基膦酸衍生物回收率的影响
Fig.4 Effect of the amount of GCB added in 2 mL extract on the recoveries of derivatizations of glyphosate（PMG）and aminomethyl phosphonic acid（AMPA）

在 2 mL 衍生液中分别加入 10、25、50、75、100 mg GCB。GCB能去除部分色素、类胡萝卜素、固醇和具有平面结构等极性大的基质干扰物，过多的GCB会对目标化合物产生吸附，因此，最终选用GCB用量为25 mg。

综合各种因素，在2 mL衍生液中加入50 mg PSA、25 mg C18、25 mg GCB组合净化剂较好。

2.4 线性范围、检出限和定量限

以一系列质量浓度（5 μg/L～500 μg/L）的标准溶液，在确定的色谱和质谱条件下进行测定。以峰面积为纵坐标、质量浓度（单位μg/L）为横坐标绘制标准曲线。以3倍信噪比计算检出限（LOD），以10倍信噪比计算定量限（LQD）。草甘膦和氨甲基膦酸衍生物的线性方程、相关系数、检出限和定量限见表2。

试验结果表明，草甘膦和氨甲基膦酸衍生物的标准曲线的线性关系良好，相关系数（r2）均大于0.999 0。草甘膦和氨甲基膦酸的检出限分别是0.01 mg/kg和0.005 mg/kg；定量限分别是0.03 mg/kg和0.015 mg/kg。

表2 草甘膦和氨甲基膦酸衍生物的线性方程、相关系数、方法检出限和方法定量限
Table2 Linear equations，correlation coefficients，LOD，and LQD of derivatizations of glyphosate（PMG）and aminomethyl phosphonic acid（AMPA）

2.5 方法的准确度和精密度

为了验证QuEChERS前处理方法联合GC-MS/MS测定茶叶中草甘膦和氨甲基膦酸的可行性和准确性，试验采用不同空白茶叶基质样品（绿茶、红茶、乌龙茶）进行加标回收率验证，加标水平分别为0.50、1.00、2.50 mg/kg，按照前述方法处理平行测定6次，回收率和精密度见表3。

表3 不同空白茶叶基质中草甘膦和氨甲基膦酸的加标回收率和精密度（n=6）
Table3 Average recoveries and relative standard deviation（RSD）of glyphosate（PMG）and aminomethyl phosphonic acid（AMPA）in different matrix（n=6）

试验结果表明，不同茶叶基质中草甘膦和氨甲基膦酸的方法回收率分别为86.1%～101.2%和83.6%～103.4%，相对标准偏差分别为3.2%～6.7%和3.6%～7.3%，低于10%。图5为0.50 mg/kg加标绿茶样品的二级总离子色谱图。

图5 0.50 mg/kg加标绿茶样品溶液中草甘膦和氨甲基膦酸衍生化合物的定量离子色谱图
Fig.5 Quantitative ion chromatograms of derived compounds in 0.50 mg/kg spiked concentration levels of green tea

3 结论

本试验通过对前处理方式、净化剂用量的优化，建立了茶叶中草甘膦及氨甲基膦酸残留量的柱前衍生-QuEChERS-气相色谱-串联质谱法分析方法。该方法简单、快速、基质干扰小、灵敏度高、重复性好，适用于茶叶中草甘膦及氨甲基膦酸残留量的定量检测，可为茶叶的安全监管及质量控制提供技术支持。

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